人血管紧张素I标准品NIST SRM 998材料来源

人血管紧张素I标准品NIST SRM 998材料来源

该材料从Beckman Instruments,股份有限公司,Bioproducts Operations(Palo Alto,CA)获得。

人血管紧张素I标准品制备

使用在5000 kPa压力下操作的25 cm x 0.4 cm十八烷基硅烷柱,对溶解的25µg该SRM样品进行液相色谱。将样品溶解在81体积份0.1mol/L pH为3.5的磷酸三乙胺缓冲液和19体积份乙腈的溶液中。使用了两种洗脱液溶液:一种是用于溶解SRM的相同组成的溶液;另一种是75体积份缓冲液与25体积份乙腈的溶液。通过在215nm和280nm处测量吸光度来监测洗脱。在81∶19的洗脱液比下,在215nm处检测到保留时间分别为16.6分钟和12.2分钟的主峰和次峰,并且在280nm处仅检测到主峰。收集对应于每个峰的材料,在6mol/L HCl中水解并分析氨基酸组成。主峰的氨基酸含量表明它是血管紧张素I。次峰(在215nm处吸光度的1%)不包含可检测的肽物质。在这些HPLC条件下,乙酸盐在溶剂前沿洗脱,不能定量。在75:25的洗脱液比例下,在任一波长都没有检测到额外的峰,这表明不存在非肽的紫外线吸收材料。NIST SRM 998

通过使用400MHz NMR光谱仪在脉冲傅立叶变换模式下测定SRM的六个样品的乙酸盐含量。通过将整个样品(约0.5mg)溶解在0.5mL氧化氘(100原子%D)中来制备用于该分析的溶液。向每种溶液中加入少量4,4-二甲基-4-硅戊酸钠2,2,3,3-d4作为内标。因为发现1.922的乙酸甲酯质子信号与血管紧张素I的质子信号重叠,所以最初制备血管紧张素Ⅰ的不含乙酸盐的样品,以确定乙酸盐峰下信号的准确质子计数。通过用0.02mol/L HCl对材料进行两次冷冻干燥来实现从该样品中去除乙酸盐。通过质子NMR对该样品的分析表明其不含乙酸盐,并且在感兴趣的光谱区域中的质子计数为3。此后,在不冷冻干燥的情况下分析SRM的样品,并从乙酸甲酯峰及其潜在信号的总积分中减去三个质子的适当积分值,以获得乙酸峰的积分。三个质子的积分的适当值是通过对高场区域中总共29个质子信号的积分进行平均来确定的,其中包括许多源自血管紧张素I的甲基、亚甲基和次甲基质子的信号。质子信号的数字积分绘制在图表纸上,并手动测量。使用了以下仪器参数:数据集大小,16384点;4µs(30°翻转角度);频谱宽度,4kHz;扫描次数,2000次;弛豫延迟1.95s。