NIST SRM 1955冷冻人血清中同型半胱氨酸和叶酸标准品

NIST SRM 1955的折叠测量：对于NIST的5MT测量，使用了三种基于LC/MS/MS的方法变体[3，4，9]。

冷冻人血清中同型半胱氨酸和叶酸标准品方法1：对于每个样品，在500μL SRM 1955等分试样中加入[13C5]-5MT储备标准，立即用等体积的含有（质量浓度）10%抗坏血酸和1%乙二胺四乙酸（EDTA）的水溶液稀释，并在冰上平衡≥15分钟。使用C18 SPE柱从样品中提取5MT：甲醇、水和1%抗坏血酸/1%EDTA溶液用于调节，95+5水+甲醇溶液用于洗涤，1%抗坏血酸/1%甲酸在50+50水+甲醇中用于分析物洗脱。使用具有电喷雾电离源和三重四极质量分析仪的商用LC/MS/MS仪器进行提取物分析。使用甲酸在水和甲醇中的梯度在苯基丙基LC柱（3.9 mm×150 mm，4μm粒径）上进行LC分离。在多重反应监测（MRM）模式下对5MT和[13C5]-5MT进行LC/MS/MS检测和定量。针对质子化的分析物分子[M+H]+和稳定的质子化片段，对每种分析物的MRM转变进行了单独优化。对于5MT，相关的MRM质量转变为m/z 460→m/z 313，而对于[135]-5MT，则为m/z 465→m/z 313。通过线性插值从独立构建的每组样品的校准曲线计算分析物浓度。

冷冻人血清中同型半胱氨酸和叶酸标准品方法2：按照方法1，对试验部分进行加标和平衡。用偏磷酸沉淀蛋白质，并通过加入含有0.4mol/L K2HPO4和0.5mol/L NaOH的溶液来中和剩余的上清液。使用固相亲和萃取（SPAE）柱从样品中提取5MT：1%抗坏血酸（质量浓度）和0.1mol/L甘氨酸-HCl溶液（pH 3.0），水和50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.4）用于调节，水用于洗涤，抗坏血酸/甘氨酸-HCl液用于分析物洗脱。按照方法1进行LC/MS/MS。

冷冻人血清中同型半胱氨酸和叶酸标准物质方法3：对于5MT和FA的分析，样品制备和仪器与方法1所述相同。在C18 LC柱（4.6mm×150mm，粒径5μm）上，使用甲酸在水和甲醇中的梯度进行LC分离。在多重反应监测（MRM）模式下对5MT/[13C5]-5MT和FA/[13C5]-FA进行LC/MS/MS检测和定量。针对质子化的分析物分子[M+H]+和稳定的质子化片段，对每种分析物的MRM转变进行了单独优化。MRM质量转变：对于5MT，m/z 460→m/z 313，对于[13C5]-5MT，m/z 465→m/z 313FA，m/z 442→m/z295 FA，以及对于[13C5]-FA，m/z 445→m/z 295。通过对每组样品独立构建的校准曲线进行线性插值计算分析物浓度。

冷冻人血清中的同型半胱氨酸和叶酸标准参考物质测量：为了在美国疾病控制和预防中心使用LC/MS/MS[5]测量叶酸（5MT、FA和5FT），使用苯基固相萃取柱从275μL SRM 1955血清中定量分离目标分析物，然后在C8分析柱上使用乙酸在有机溶剂中的等度流动相，通过正离子电喷雾电离LC/MS/MS在稳定的血清提取物中检测和定量。使用13C-标记的叶酸盐作为内标。对于总叶酸的CDC微生物测定[12]，使用96孔板微量滴定法，将稀释的SRM测试部分添加到含有干酪乳杆菌（干酪乳杆菌，NCIB 10463）生长所需的除叶酸之外的所有营养素的测定培养基中。然后用干酪乳杆菌接种测定培养基，并将微量滴定板在37℃下孵育42小时。因为干酪乳杆菌的生长与血清样品中存在的总叶酸的量成比例，所以通过在微板读数器中测量590nm处接种的测定介质的浊度来定量叶酸浓度。对于总叶酸和维生素B12的CDC放射测定，使用了放射性蛋白结合测定法。SRM的测试部分与示踪剂125I叶酸和57Co维生素B12组合。将混合物煮沸以使内源性叶酸结合蛋白失活，并将各种形式的维生素B12转化为氰钴胺。冷却后，将混合物与固定化的亲和纯化的猪固有因子和叶酸结合蛋白结合，在室温下孵育1小时，最后离心和倾析。内源性和标记的叶酸和B12根据其相对浓度竞争有限数量的结合位点，并以颗粒的形式浓缩在管的底部。将上清液中未结合的叶酸和维生素B12丢弃。对与颗粒相关的放射性进行了计数。通过在人血清白蛋白基础中使用预先校准的叶酸/维生素B12标准品来制备标准曲线。SRM中叶酸和维生素B12的浓度由标准曲线计算